Comment ensemencer un milieu de culture avec des billes de verre ?

 

par juju27 |

     

L'ensemencement par billes de verre permet de répartir la solution microbienne sur la totalité de la surface d'un milieu solide. Cette technique a pour but de dénombrer la quantité de micro-organismes présents dans la solution.
Cette méthode est peu complexe mais nécessite malgré tout de la rigueur et doit se dérouler selon un protocole précis.
Conseils et méthodes ...

Quelles sont les fournitures nécessaires ?

  • un bec bunzen
  • des billes de verre
  • des boîtes de Pétri remplies d'un milieu solide
  • une solution microbienne à analyser
  • une micropipette
  • des cônes pour micropipette

Étapes de réalisation

1.

Commencez par nettoyer votre zone de travail avec de l'alcool afin de ne pas contaminer votre boîte de Pétri avec des organismes malvenus.

2.

Allumez le bec bunzen en essayant d'obtenir une flamme bleue.
Cela a pour but de stériliser l'air alentour dans un rayon de 10 centimètres environ, et ainsi d'éviter toute contamination liée à l'air.
Vous ne devez donc pas vous en écarter durant la manipulation.

3.

Avant de commencer, inscrivez sue le côté ou sur le dessous de la boîte de Pétri, le nom du milieu solide utilisé, ainsi que la concentration de la solution de micro-organismes avec laquelle vous allez l'ensemencer.
Pour cette méthode, il convient de diluer la solution à différentes concentrations, et de réaliser 3 boîtes pour une même concentration, et cela dans un soucis de précision.

4.

Prélevez 1 millilitre de la solution microbienne à l'aide de la micropipette, que vous aurez préalablement dotée d'un cône adéquat, en utilisant de préférence une p1000, que vous réglerez donc sur "100".

5.

Ouvrez la boîte de Pétri et déposez y le contenu de la micropipette au centre.

6.

Munissez-vous des billes de verre préalablement autoclavées, et déposez-en une dizaine à la surface de votre milieu solide.

7.

Refermez la boîte de Pétri et faîtes un mouvement de va et vient verticale afin de déplacer les billes de haut en bas, pendant une dizaine de secondes.

8.

Tournez votre boîte d'un quart de tour vers la droite, et renouvelez l'opération de va et vient verticale.

9.

Tournez à nouveau votre boîte d'un quart de tour vers la droite, et faîtes le même mouvement de va et vient.
Tournez-la une dernière fois d'un quart de tour vers la droite, et effectuez toujours ce même mouvement.

10.

Une fois le tour de cercle complet effectué, retournez vos boîte, de sorte que le couvercle soit côté table.
Ne laissez jamais les billes reposées directement sur le milieu une fois l'étalement effectué, cela aurait pour conséquence de "creuser" le milieu.

11.

Une fois que toutes vos boîtes sont étalées avec la solution microbienne, ôtez les billes des boîtes en ne les ouvrant que très légèrement, afin de limiter les risques de contamination.
Déposez les billes dans une poubelle de table. Celles-ci devront absolument être autoclavées avant d'être réutilisées.

12.

Faîtes incuber vos boîtes de Pétri.

13.

Au retour de l'incubation, plusieurs cas s'offrent à vous :
- soit vous avez un tapis bactérien et dans ce cas aucun dénombrement n'est possible.
- soit vous avez des colonies isolées mais en nombre trop conséquent pour être comptées.
- soit vous avez des colonies isolées suffisamment espacées pour être dénombrées.

14.

On estime que pour être dénombrée, une boîte doit contenir entre 30 et 300 colonies.

15.

Comptez donc les colonies isolées de vos 3 boîtes de même concentration (cf étape 3), et réalisez la moyenne.
Vous obtenez ainsi la concentration bactérienne de votre solution en UFC/mL pour la concentration de la boîte.

ATTENTION, ce résultat ne correspond pas à la concentration de la solution de départ utilisée, puisque vous l'avez dilué.

Astuces et mises en garde

Astuce(s) :

Vous pouvez ensemencer plusieurs boîtes en même temps avec les billes (max 3), afin de gagner du temps. Mais dans ce cas, soyez rapide pour déposer les billes dans toutes vos boîtes, afin que les billes ne creusent pas le milieu.

UFC signifie "Unité Foramnt Colonie". C'est à dire qu'il ne s'agit pas de compter tous les organismes, mais uniquement ceux à l'origine d'une colonie de plusieurs organismes.

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