Comment réaliser une coloration de Gram ?

 

par juju27 |

     

La coloration de Gram (nom venant de son auteur), sert à différencier les bactéries grâce à la composition de leur membrane. Ainsi, nous notons l'existence de Gram + et de Gram -.
Cette coloration, rapide à réaliser permet également de connaître la forme des bactéries observées (coques,bacilles ...).
Protocole ...

Quelles sont les fournitures nécessaires ?

  • une lame
  • une lamelle
  • une solution bactérien ou une colonie
  • un bec Bunzen
  • des prismes
  • des tubes Borel
  • de l'eau distillée
  • du Cristal Violet (solution aqueuse à 0.5%)
  • de la Safranine (solution aqueuse à 0.5%)
  • du Lugol
  • de l'alcool 95°

Étapes de réalisation

1.

Réalisez au préalable un frottis bactérien fixé, en étalant l'échantillon sur une lame de verre.
Puis, séchez la préparation à l'air, et fixez-la à l'aide de la flamme orange d'un bec Bunzen.

2.

Avant de commencer la coloration, rappelez-vous bien du côté de la lame qui contient le dépôt bactérien.
En effet, étant donné que vous allez devoir l'observer au microscope par la suite, ce "détail" revêt une importance cruciale, surtout qu'une fois les différents bains de couleur effectués, il sera difficile de distinguer ce côté à l'oeil nu.

3.

Afin de faciliter la coloration, remplissez 4 tubes Borel des différentes solutions, et introduisez-y un prisme, afin de pouvoir réaliser plusieurs lames en simultané si l'envie vous en dit.

4.

Plongez tout d'abord le frottis dans un bain de Cristal Violet, et cela pendant 1 minute.

5.

Rincez ensuite la lame sous un léger filet d'eau distillée à l'aide d'une pissette.

6.

Plongez ensuite la lame dans un second bain de Lugol pendant 1 minute.
La solution de Lugol est composé d'1g d'iode, de 2g d'iodure de potassium et d'eau en quantité suffisante pour 100 mL.

7.

Rincez à nouveau à l'eau distillée.

8.

Plongez ensuite la lame dans l'alcool à 95° durant 20 secondes.
Lors de cette étape, veillez à "secouer" la lame légèrement pendant qu'elle trempe dans la solution.

9.

Rincez une nouvelle fois la lame à l'eau distillée.

10.

Plongez enfin la lame dans un bain de Safranine durant environ 30 secondes.

11.

Rincez la lame à l'eau distillée, et séchez-la délicatement.

12.

Observez la lame au microscope, à l'objectif x100 (utiliser l'huile à immersion).

Astuces et mises en garde

Mise(s) en garde :

Lorsque vous rincez la lame avec la pissette d'eau distillée, veillez à ne pas diriger le jet d'eau directement sur les cellules microbiennes. Arrosez plutôt le sommet de la lame, en laissant couler l'eau le long de celle-ci, jusqu'en bas.

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