Comment marquer une protéine par fluorescence ?

 

par semix |

     

Le meilleur moyen de regarder si une protéine est présente dans un échantillon est de la rendre fluorescente, sa présence vous sautera ensuite aux yeux. Le plus difficile est de trouver une seconde protéine qui a une forte affinité avec la protéine recherchée, pour qu’il y ait interaction entre les deux. Cette interaction émet une fluorescence ou un fluorochrome peut être couplé à la deuxième protéine.

Quelles sont les fournitures nécessaires ?

  • Microscope à épifluorescence
  • Une solution de PAF
  • Une solution de PBS
  • Une solution de BSA
  • Du parafilm

Étapes de réalisation

1.

Récupérez votre culture cellulaire, qui a été préalablement ensemencée avec des cellules contenant vos protéines cibles. Lavez-les avec du PBS (Phosphate Buffered Saline), pour supprimer toute trace du milieu de culture, qui pourrait bloquer les interactions futures.

2.

Utilisez une solution de PAF (paraformaldéhyde), qui permet de fixer les cellules (prenons l’exemple le plus courant, celui de l’actine dans le cytosquelette comme protéine cible). Laissez agir le produit environ 15 minutes à température ambiante.

3.

Rincez votre préparation à l’aide de PBS pendant 10 minutes. Ne surtout pas utiliser d’eau, cela fera exploser vos cellules, à cause d’une pression osmotique trop élevée.

4.

Trempez votre lame contenant la protéine cible dans une solution de Triton environ 10 minutes et à température ambiante. C’est un détergent qui permet d’avoir accès au cytoplasme, ainsi qu’aux protéines qui sont à l’intérieur. Si la protéine que vous cherchez se trouve sur la membrane plasmique, ne réalisez pas cette étape.

5.

Lavez une nouvelle fois vos cellules, en les laissant tremper dans un bain de PBS pendant 15 minutes.

6.

Placez vos préparations dans une solution de BSA pendant 10 minutes. C’est un agent de saturation qui évite les bruits de fond lors de l’observation.

7.

Procurez-vous une protéine qui a une forte affinité avec celle que vous recherchez. Elle doit être couplée avec un fluorochrome, pour obtenir une fluorescence. Ce genre de « complexe » se trouve assez facilement dans le commerce spécialisé. Si on poursuit avec l’exemple de l’actine, dans notre cas la protéine secondaire sera la phalloïdine et le fluorochrome sera la rhodamine, qui colorera en rouge.

8.

Placez votre complexe (phalloïdine-rhodamine) sur du papier parafilm, retournez votre lame au-dessus afin de mettre en contact la préparation et les réactifs. Laissez agir environ une heure dans le noir pour ne pas exciter votre fluorochrome.

9.

Rincez une nouvelle fois au PBS.

10.

Montez votre échantillon entre lame et lamelle, à l’aide d’une goutte de PBS. Les bords de la lamelle seront recouverts de vernis à ongles pour faciliter la fixation entre les deux supports.

11.

Observez votre préparation avec un microscope à épifluorescence qui excitera votre fluorochrome et vous permettra de localiser votre protéine cible.

Astuces et mises en garde

Astuce(s) :

Respectez soigneusement tous les lavages.

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